Штаммы бактерий и культивирование. В данном исследовании использовались преимущественно три штамма Z. ramigera: IAM 12136 (= штамм 106T), IAM 12669 (= штамм I-16-M) и IAM 12670 (= штамм 115), а также зооглея вида ATCC 19324. Кроме того при изучении гомологии ДНК были использованы штаммы ATCC 19173, ATCC 19123, AS180, AS456 и AS480. В качестве контрольных организмов были добавлены несколько штаммов устоявшихся видов протеобактерий подкласса «р» (28). Перечень штаммов, подвергшихся исследованию, можно увидеть в таблице 2. Штаммы с IAM номерами были получены из Центра коллекции культур Института прикладной микробиологии, Университет Токио (Токио, Япония); штаммы с ATCC номерами поступили из Американской коллекции типовых культур (Роквил, штат Мэриленд), и, наконец, штаммы с номерами AS — из нашей коллекции. Среда определенного химического состава, называемая LYS, использовалась для разведения штаммов зооглей, в то время как сложная среда, называемая PBY, использовалась для всех других организмов. Клетки были выращены аэробно в пробирках или колбах Эрленмейера на вибрационных возвратно-поступательных шюттель-аппаратах при температуре 30С, собраны путем центрифугирования на ранней стационарной фазе роста, промыты соляным раствором с применением ЭДТК (0,15 м. ЭДТК плюс NaC1 на 0,15 м., pH фактор 8,5) и до использования хранились при температуре −20C.

Извлечение ДНК. Геномная ДНК была извлечена и очищена методом Мармура. Поскольку очистить ДНК от штаммов зооглей при наличии студенистого межклеточного материала оказалось сложно, до начала процесса извлечения клетки были обработаны 0,1 N NaOH в течение 10 минут при температуре 4C, чтобы удалить этот студенистый материал, а затем дважды промыты холодным соляным раствором с ЭДТК.

Усиление рибосомной ДНК 16s. Ген рибосомной ДНК 16s был усилен ЦРП, для осуществления которой в качестве матрицы использовался 1 лист геномной ДНК при 100-кратном объеме реакции. Реакция была выполнена в стандартных цикличных условиях с использованием имеющегося в свободной продаже комплекта реактивов ЦРП и ряда эубактериальных согласованных олигодезоксинуклеотидных праймеров, как уже было описано ранее. Усиленную ДНК обработали хлороформом с осадком этанола и очистили электрофорезом в агарозном геле, из которого она была извлечена с помощью комплекта Sephaglas BandPrep (Pharmacia LKB Биотехнология, Упсала, Швеция), что указанно производителем.

Секвенирование. Для проведения реакций секвенирования были использованы пять олигодезоксинуклеотидных праймеров, маркированных флуоресцинизотиоцианатом в 5 местах. Четверо из вышеуказанных праймеров совпали с набором позиций от 1406 до 1389, от 1111 до 1093, от 821 до 803 и от 536 до 518 в нумерации рибосомной ДНК 16s кишечной палочки, как было описано ранее. Оставшийся праймер оказался гомологичным ряду позиций от 1091 до 1109 (5-TAAGTCCCGCAACGAGCGC-3) в системе нумерации данного микроорганизма. Все пять праймеров были предоставлены компанией Takara Suzo Co. (Киото, Япония). Реакции секвенирования были проведены методом линейного секвенирования ЦРП (циклическое секвенирование) при помощи реактивов компании Pharmacia AutoCycle, что также было описано ранее. До проведения анализа реакционные смеси хранились при температуре −20C. Непосредственно перед процедурой электрофореза они были денатурированы путем нагрева при 95C в течение 3 минут, а затем быстро охлаждены в ледяной воде.

При выполнении автоматизированного электрофореза и анализа последовательных реакций ДНК был использован секвенатор с 0,5-мм спейсерами и 5%-ым акриламидным гелем производства компании Pharmacia A.L.F.

Филогенетический анализ данных. Последовательности были компилированы согласно данным о перекрывающих клонах, обработанным автоматически и вручную, выровнены и рассчитаны на наличие сходства посредством программы GENETYX (Software Development Co., Токио, Япония) на персональном компьютере Apple Macintosh. Расчет скорости нуклеотидного замещения и построение дерева матричных расстояний было выполнено методом ближайшего связывания с помощью программы CLUSTAL V. Промежутки при выравнивании и неопределенные или сомнительные основные позиции при вычислениях не учитывались.

В программе CLUSTAL V также использовался параметр «бутстрап», который запускался 1000 раз с целью передачи интервалов со степенью достоверности каждому узлу филогенетического дерева.

Авторы: Йонг Кук Шин, Акира Хираиши, Джанта Сагияма